Premda je Strossmayer bio đakovački biskup, odlučio je galeriju smjestiti u Zagreb, hrvatski glavni grad i kulturno središte. Isprva je želio u tu svrhu prostor na Gornjem gradu, no dodijeljena mu je mnogo zabačenija lokacija kod nekadašnjeg stočnog sajma, na samom rubu tada izgrađenog područja Zagreba (današnji Zrinjevac). Kad je palača akademije dovršena bila je posljednja zgrada na tom području, a južno od nje prostirala su se polja. Danas se galerija nalazi u samom centru grada na jednom od najljepših gradskih trgova.

Strossmayerova galerija starih majstora i danas se nalazi u palači Akademije, na južnom rubu Zrinjevca. Izvorno je sadržavala 256 umjetničkih djela, no u međuvremenu je njihov broj povećan na nekoliko tisuća. Među zastupljenim umjetnicima u galeriji nalaze se Andrija Medulić, Beato Angelico, Vittore Carpaccio, El Greco, Jacopo Palma il Giovane, Federico Benković, majstor slike Virgo inter virgines, Jacob van Ruisdael, Jean-Antoine Gros, Jan Wellensz de Cock, Joachim Patenier i mnogi drugi.